会议报道长城检验医学会议前沿技术论坛

靓点2循环血癌细胞检测步入“正当年”

液体活检（liquidbiopsy），作为体外诊断的一个分支，是指通过检验血液或者其他体液如尿液、唾液、胸腔积液、脑脊液等，对癌症等疾病做出分析诊断。包括循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、microRNA、微泡（外泌体）。其中CTC与ctDNA发展最为迅猛。目前液体活检主要应用领域是肿瘤的血液检测，即利用血液提示肿瘤发展进程及抗药性等信息，指导个体化精准治疗。

CTC指从实体瘤或转移性肿瘤病灶自发性或因诊疗操作导致而释放入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，。年,Ashworth在血液循环发现一种同肿瘤细胞相似的血细胞,从而首次提出了CTC的概念。CTC在血液循环中可单个存在，也可堆积成团。目前学者将由2个或2个以上的CTC堆成的细胞簇或CTC粘附其他血细胞簇称为循环肿瘤微栓子（circulatingtumormicroembli,CTM。CTM因CTC被包裹在簇中间而导致表面标志物无法暴露，故可以逃避免疫监视，比单个CTC的增殖潜力和转移瘤的形成能力更强，生存优势更为明显。由于体内CTC的数量很少，每~个白细胞中才会发现一个CTC，检测限较低，因此临床上需要提供敏感性、特异性较高的CTC检测方法。

1.CTC的检测

CTC的检测主要包括富集筛选和细胞鉴定两大步骤。富集CTC的方法主要有过滤法、密度梯度离心法和捕获法三种。过滤法是根据肿瘤细胞体积大于白细胞体积的原理来分离CTC，代表技术为膜过滤法分离上皮来源肿瘤细胞（ISET）。过滤法的特点是可分离细胞角蛋白（CK）阳性和CK阴性细胞，检出循环肿瘤微栓子，用血量较少（1ml），但是局限性在于不易检出过小（8um）的肿瘤细胞。密度梯度离心法是根据肿瘤细胞和白细胞密度不同来分离CTC，代表技术是OncoQuick分离体系。它的优势是也可以可分离CK阳性和阴性细胞。但是CTC可能迁移至血浆层，红细胞、白细胞层从而丢失，CTM可能迁入红细胞层从而而造成丢失。捕获法的原理是将特异性抗体包被在已有同源二抗的磁珠上制成免疫磁珠，再与靶细胞上抗原结合成“靶细胞-抗原抗体-磁珠”复合物，在外在磁场作用下向一定方向移动，从而富集靶细胞。其分选策略包括阳性富集、阴性筛选以及阳性富集+阴性筛选。阳性富集技术主要采用抗CTC表面标记分子即上皮细胞粘附分子（epithelialcellularadhesionmolecule,EpCAM）结合免疫磁珠捕获CTC，已被美国FDA获批的自动化CTC检测系统-Cellsearch系统就是利用此原理进行CTC筛选。这种方法适用于EpCAM或CK阳性的CTC，例如乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌。而对EpCAM或CK阴性的CTC例如黑色素瘤、部分膀胱癌及胰腺癌等不适用。癌症在转移过程中发生上皮间质变（epithelialmesenchymaltransition，EMT）导致上皮标志丢失，故利用捕获上皮标志物的技术容易导致肿瘤细胞的漏检。阴性富集技术利用标记白细胞表面抗原的磁珠抗体吸附白细胞，在磁场作用下去除白细胞，使得CTC被富集沉淀。此方法的优势在于可以检出EpCAM或CK阴性的CTC，能够有效避免癌症发生EMT而导致CTC阳性率低。

临床上常用的CTC鉴定技术是利用显色剂标记肿瘤相关性抗原角蛋白CK8、CK18、CK19的单克隆抗体以鉴定筛选的细胞。但是目前尚无针对CTC的特异性抗原，故容易造成假阳性或假阴性结果。上皮细胞特异性抗体不仅能特异性标记非肿瘤上皮细胞,还有可能非特异性标记非上皮性的非肿瘤细胞(如白细胞等)，可能造成假阳性结果。良性上皮细胞增殖性疾病、炎症、组织创伤、手术干预以及不当的采血操作等也有可能致使外周血中检测到数量不等的上皮细胞。但Pan等构建了一种针对非小细胞肺癌特异性的单克隆抗体-NJ,为基于抗原抗体结合的免疫细胞化学检测方法提供新的实验依据，但其此抗体仍然需要进行临床试验加以验证。

2.CTC的临床应用

CTC检测方法不同，不同检测方法的临床诊断价值均需要做出临床评估。某些癌肿早期可以发现CTC，CTC对于早期癌症的辅助诊断具有一定价值。CTC计数最主要的用途是与CT扫描联合检查应用于晚期肿瘤患者治疗应答的评价，其基线水平也可以用于晚期肿瘤患者生存期的预测（见图3）。

图3CTC检测的应用

例如染色体多倍体扩增的CTC鉴定技术也逐步应用于临床。多项研究[采用该技术证实了肺癌、乳腺癌、胃癌、直接肠癌和胰腺癌中存在染色体7号、8号多倍体扩增。医院的初步研究发现7例I-II期、18例III期和25例IV期一线治疗前的原发性肺癌CTC[DAPI（+）CK（+/-）CETP8（+）CD45(-)）]阳性率（CTC≥2/3.4ml）分别为57.14%（4/7）、83.33%（15/18）和92%（23/25）。其后更大样本量的临床研究显示出类似的结果，各期CTC阳性率显著高于血清肿瘤标志物，CTC对于晚期肺癌化疗效果评价与CT具有良好的一致性。

a

b

图4不同期肺癌患者CTC个数/阳性率和晚期肺癌一线化疗2周期CTC的水平

本分论坛邀请到CTC联盟成员，包括中科院纳米中心的胡志远、上海柏慧康生物科技有限公司的沈鹤松、武汉介观生物科技有限责任公司的韩超、宜昌镁光硅谷生命科技股份责任公司邓亚光、杭州华得森生物有限公司刘艳省5个企业来分享他们的CTC前沿检测技术及其在肿瘤诊治中的价值。医院的刘毅教授前来助阵。

靓点３　对于微生物MALDI-TOFMS鉴定又添新成员

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）是20世纪80年代发展起来的一种新型软电离有机质谱。年，该技术获得诺贝尔化学奖，评奖委员会认为该技术突破了生物大分子质谱分析的难题，在临床诊断领域具有巨大应用潜力。

年，马庆伟等人《MALDI-TOFMS引领分子诊断新时代》在《生物技术世界》发表；年美国FDA批准MALDI技术用于微生物蛋白指纹图谱鉴定；年美国FDA批准MALDI技术用于莱顿第五凝血因子和第二凝血因子基因分型检测；年基于MALDI-TOF质谱平台的Veristrat非小细胞肺癌靶向用药指导技术写入美国NCCN指南；年，IgG糖基检测——预测生物年龄项目首次建立中国人数据模型，再度引发了质谱热潮。

1.微生物蛋白指纹图谱鉴定

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)指纹图谱法是一种微生物分类和鉴定的快速可靠的方法，可广泛应用于临床诊断、环境和分类研究或者食品加工质量控制中。每种微生物都有自身独特的蛋白质组成，因而拥有独特的蛋白质指纹图谱。在MALDI-TOF质谱仪中，激光激发靶板上的细菌与基质让细菌的蛋白在真空的飞行管中。检测器通过检测蛋白飞行时间的不同来建立一个曲线图谱进而与数据库中的信息比对，得出待测菌的种。MALDI-TOF质谱仪指纹图谱法可使研究人员在几分钟内就可鉴定不明细菌、真菌和分枝杆菌。

继BRUKER和VITEK后，Clin-TOFMS及其配套的BioExplore数据库，具有强大可靠的数据处理能力，是微生物鉴别与分类中的最新技术。BioExplore软件通过Clin-TOFMS质谱仪测得待测微生物的蛋白质指纹谱图，对这些指纹谱图进行处理并和数据库中各种已知微生物的标准指纹图谱进行比对，从而完成对微生物的鉴定。与现有传统的微生物鉴定技术相比，具有操作简单、快速、通量高、灵敏度高、准确度好、试剂消耗少等优势。

《中华检验医学杂志》年1月第40卷第1期，范欣等人研究文章“国产基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统Clin-TOFMS与BrukerBiotyper质谱系统在革兰阴性菌的鉴定效能评估”中报道，Clin-TOF质谱系统准确鉴定率为98.5%（/），Bruker质谱系统准确鉴定率为99.22%（/），表明CLIN-TOF在临床微生物鉴定方面已与德国布鲁克质谱系统鉴定效能相当。Clin-ToF飞行时间质谱系统的研究成果，已在该领域跃居世界先进水平（参考文献：范欣,肖盟,徐志鹏,等.国产基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统Clin-TOF-ⅡMS与BrukerBiotyper质谱系统在革兰阴性菌的鉴定效能评估.中华检验医学杂志，,40(1):41-45.）。

2.MALDI-TOF质谱或可应用于肺癌TKI治疗的疗效预测

蛋白质是在体内实现各种功能的主要物质，随着疾病的发展，相关的蛋白质则一定会产生相应的变化，而且变化的种类，幅度和组合数目远超过基因，因此通过检测血清中蛋白质的变化或可从基因检测以外的角度提供一个新的思路。MALDI-TOF质谱是一种常用于蛋白质多肽研究的平台，其肽质量指纹图谱技术(PeptideMassFingerprinting,PMF)可通过对比不同疾病组间的峰图建立检测模型，并通过模型对样本进行分类，该技术已被成熟的应用于临床微生物鉴定多年，但一直未被应用于肿瘤的诊疗。

年美国学者Carbone，DPetal.小组，在MALDI-TOF质谱平台，应用PMF技术成功建立了一种可用于预测厄洛替尼治疗效果的方法，完全独立于EGFR突变基因检测之外。该方法主要检测血清中多肽的变化，其结果可将病人分为”Good”组（即，疗效好组）和”Poor”组（即，疗效差组），经过未曾做过EGFR突变检测的96例一线厄洛替尼治疗的非小细胞肺癌患者回顾性血清样品(ECOGprotocolE)验证时发现，69例分类为Good组的病人在一线治疗中服用厄洛替尼后，中位生存期为天，远远高于27例中位生存期为天的Poor组病人（参考文献：TaguchiFetal.JNatlCancerInst.;99(11):-）。

这种基于蛋白质组学的检测方法是独立于基因检测之外的一种新思路。与基因检测所







































初期白癜风能治好吗
早期白癜风是否能治愈