新稿速递笋壳醋酸木质素的提取及抗氧化活

北京白癜风的价格是多少 http://pf.39.net/bdfyy/
笋壳醋酸木质素的提取及抗氧化活性研究

龚卫华1,2,冉占祥1,向卓亚1,叶发银1,赵国华1,3*

1(西南大学食品学院，重庆，)2(吉首大学师范学院，湖南吉首，)3(重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆，)

摘要：以麻竹笋笋壳为原料，采用醋酸法提取笋壳木质素。通过单因素试验及响应面分析，探讨提取时间、盐酸添加量、液料比和醋酸体积分数对木质素提取率的影响，并对提取的醋酸木质素基本成分及抗氧化活性进行研究。结果表明：醋酸木质素提取的最佳工艺参数为，提取时间80min,HCl添加量6%，液料比20∶1(mL∶g),醋酸体积分数86.95%。该条件下笋壳木质素提取率达到73.58%(相对于Klason木质素含量)，且木质素的纯度达到89.70%，含有少量的碳水化合物(2.96%)。醋酸木质素的DPPH自由基清除指数(RSI)值为1.61，显著高于商业合成抗氧化剂BHT的RSI值(0.94)，具有应用于食品及其他工业抗氧化剂的潜力。

关键词：响应面；木质素；笋壳；成分分析；抗氧化活性

麻竹笋(Dendrocalamuslatiforus)是中国产笋量较高品种之一，具有较高营养价值[1]。目前，竹笋除鲜食外，还被制成笋干和罐头，但是食用的笋肉只占笋体的30%，其余均为笋头和笋壳等下脚料[2]。近年来，人们已经意识到直接将这些下脚料丢弃造成的经济损失和环境污染，因此，对下脚料的进行相关的开发和利用是当前的研究热点。YE等[3]对麻竹笋笋壳中多元醇提取工艺和性质进行了研究；孙静亚[4]等人对竹笋壳色素的提取工艺和性质进行了研究；苏雅静[5]等对竹笋壳中黄酮类物质的提取工艺和相关性质进行了研究；但是目前针对笋壳中木质素的提取及相关性质的研究鲜有报道。木质素是具有三维立体结构的天然酚类无规则聚合物，是膳食纤维成分之一，含有较多的活性基团如：羟基、羧基、甲氧基等[6-7]，具有多种生物学活性。LI等[8]研究了从竹材中提取木质素的抗氧化活性，发现木质素的抗氧化活性要强于合成的抗氧化剂BHT，说明木质素具有应用于抗氧化剂的潜力。RODRGUEZ-GUTIéRREZ等[9]研究发现木质素对胆汁酸具有很强的吸附能力；MITJANS等[10]还研究发现，木质素具有抗癌变、抗菌、抗诱变等生物活性。醋酸是提取木质素的有机溶剂的一种，具有在常压下进行，对设备要求较低，溶液易挥发可回收利用等特点，可有效降低提取成本，且提取的木质素具有较低的分子量和较高的反应活性等[11-12]，常应用于木质素提取研究。酸不溶性木质素(Klason)是不溶于硫酸的木质素，已经成为木质素的定量的标准方法[7]。前期的研究表明，麻竹笋笋壳中Klason木质素的含量较高，因此以麻竹笋笋壳为原料，对提取木质素工艺进行优化及对其抗氧化活性进行研究，为笋壳的高附加值应用提供一个新的方向。

本文研究醋酸法提取木质素过程中提取时间、HCl添加量、液料比、醋酸体积分数对麻竹笋壳木质素提取率的影响，利用响应面法对提取工艺进行优化，并对提取的笋壳木质素基本成分及抗氧化活性进行研究。

1材料与方法

1.1材料与试剂

麻竹笋笋壳，采于重庆市北碚区竹林；DPPH、BHT(分析纯)，中国阿拉丁试剂有限公司；单糖标品(色谱纯)，美国Sigma公司。

1.2仪器与设备

IP-B高速多功能粉碎机，永康市久品工贸有限公司；88-1大功率恒温磁力搅拌器，常州国华电器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；LC-20A高效液相色谱(HPLC)，日本岛津公司；LGJ-10冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；DHG-9电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；L-1低速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；可见光分光光度计，北京金科利达电子科技有限公司。

1.3实验方法

1.3.1原料预处理

将笋壳清洗除杂、自然干燥、剪碎，置于烘箱中55℃干燥12h，粉碎取40～60目样品。然后以纯水在固液比1∶10(g∶mL)，95℃水浴条件下浸提2h(以除掉色素、淀粉等可溶性成分，断裂部分木质素与纤维素和半纤维的连接键，有利于醋酸对木质素的提取)，过滤，滤渣55℃烘干备用。

1.3.2醋酸木质素的提取工艺[11]

称取一定量经预处理样品，按照液料比15∶1(mL∶g)加入90%醋酸溶液，并添加4%的HCl作为催化剂，在℃油浴条件下反应60min后，真空抽滤，滤渣用同浓度的醋酸冲洗，并用纯水冲至中性，减压浓缩，浓缩液逐滴加入10倍体积的纯水中沉淀，离心分离，用pH2的酸水(HCl调节pH值)溶液冲洗3次，冷冻干燥，得笋壳醋酸木质素。

提取率

(1)

1.3.3醋酸木质素提取的单因素实验

单因素实验按1.3.2步骤进行提取，分别以不同的提取时间(20、40、60、80、min)、HCl添加量(0、2%、4%、6%、8%)、液料比(mL∶g)(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)及醋酸体积分数(60%、70%、80%、90%、%)为单因素，考察单因素对木质素提取率的影响。

1.3.4响应面优化醋酸木质素提取工艺

在单因素实验基础上，以提取时间、HCl添加量、液料比、醋酸体积分数为自变量，木质素的提取率为响应值，进行4因素3水平的响应面分析试验，试验设计见表1。

表1Box-Behnken方案设计的因素和水平编码值

Table1FactorsandlevelsofBox-Behnkenexperiments

1.3.5笋壳及醋酸木质素基本成分的测定

纤维素、半纤维、木质素的含量：按美国国家可再生能源实验室方法测定[13]；首先，精确称取mg样品，加入3.0mL浓H2SO4(体积分数72%)，在30℃条件下水解1h。然后,用超纯水稀释至H2SO4体积分数为4%，高压反应釜中℃条件下继续水解1h。水解结束后,自然冷却水解液，用事先恒重的砂芯漏斗过滤，通过称取滤渣的重量计算出酸不溶性(Klason)木质素的含量。滤液稀释2倍，用高效液相色谱(HPLC)分析滤液中糖含量，换算出纤维素和半纤维含量。测定条件为：色谱分离柱：AminexHPX-87H(mm×7.8mmid,9μm)；RI示差检测器；流动相:0.mol/LH2SO4(pH2)；进样体积：20μL；流动相流速:0.6mL/min；柱温：65℃。采用纤维二糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸和D-半乳糖醛酸的标准溶液进行校准。

水分、灰分、蛋白质和脂肪含量分别依据GB9.3—、GB9.4—、GB9.5—和GB/T9.6—测定。

1.3.6醋酸木质素抗氧化活性分析

参照TAO的方法[14]，采用DPPH自由基清除能力来评价木质素抗氧化能力。取0.1mL不同浓度(0.02～5.00mg/mL)木质素二氧六环溶液(体积比9∶1)，加入3.9mLDPPH溶液(0.06mmol/L溶于甲醇溶液)，混合均匀后在室温下避光反应30min。然后于nm处测定吸光值As。同时，测定空白样吸光值Ab。按下面公式计算样品对DPPH自由基清除率(S%)：

(2)

1.3.7统计分析

所有数据应用Excel软件、SPSS软件和Designerexpert软件进行处理和分析。其中，显著性分析采用Duncan检验，P0.05为不显著，P0.05为显著。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

由图1(A)可知，随着提取时间的延长，木质素的提取率逐渐升高，到达60min后呈下降趋势。主要原因可能是随着提取时间的增加，木质素溶解在醋酸溶液中程度加大，木质素得率明显提高。当达到一定时间时，已经溶解完全，继续延长提取时间，部分木质素可能因长时间反应而被分解，所以得率有所下降，但要比VILLAVERDE等[12]所用醋酸法提取木质素的时间减少，这可能与原料不同有关。从图1-B可以看出，随着HCl添加量的增加，木质素的提取率呈先增大再稍微下降的趋势，在HCl添加量为4%时，提取率达到最大。说明当HCl添加到一定量以后，继续增加会导致酸性过强，分解部分木质素，引起木质素提取率的降低，与LI等人研究的HCl添加量对醋酸木质素提取率的影响的结果一致[11]。由图1-C可以看出，木质素的提取率随着液料比增大而呈上升趋势，这是因为加液量越多越有利于木质素的溶出，但液料比为15∶1时达到最高点，继续增加液料比，提取率稍呈下降趋势，可能是因为催化剂的量被稀释，影响木质素的提取。由图1-D看出，随着醋酸体积分数的增加，木质素的提取率也随之增加，当醋酸体积分数为90%时，木质素提取率达到最大，这与XU等人的研究结果一致[15]，但继续提高醋酸体积分数时，提取率显著下降。这是因为醋酸的加入可以增大溶液的酸度，促进木素和纤维的分离，但过量的醋酸使笋壳发生炭化，使得反应液的颜色加深，从而使木质素的提取率降低。

图1各提取因素对醋酸木质素提取率的影响Fig.1Effectofextractingfactoronextractionyieldofaceticacidlignin

2.2响应面法优化试验结果分析

2.2.1回归模型方程的建立

结合单因素试验，进行Box-Behnken中心组合试验设计响应面分析，结果见表2。通过DesignExpert对表2的数据进行多元回归拟合，得到醋酸木质素的提取率对提取时间(A)、HCl添加量(B)、液料比为(C)、醋酸体积分数(D)的回归方程：

Y=63.42+5.24A+9.30B-0.97C-6.48D-1.40AB+1.77AC+1.44AD+1.08BC-8.81BD+2.83CD-1.11A2-5.53B2+1.23C2-15.48D2

(3)

2.2.2模型及回归方程系数的显著性检验

对该回归模型剔除不显著因素后进行方差分析，具体结果见表3。该模型的P0.，方程模型达到极显著，失拟项F值为5.80，P值为0..05，差异不显著，说明该模型可以用来进行响应值的预测，试验设计方案正确[16]。表3表明,A、B、D、B2、D2、BD对笋壳醋酸木质素提取率的影响极显著，

表2醋酸木质素提取试验方案与试验结果

Table2Designandresultsofextractionaceticacidlignin

表3回归方程的方差分析

Table3Varianceanalysisofregressionmodel

其他系数均不显著。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序，B(HCl添加量)、D(醋酸体积分数)A(提取时间)C(液料比)。

2.2.3醋酸木质素提取率的响应面分析

等高线是椭圆形，则表示两因素交互作用显著，是圆形则表示交互作用不显著，同时沿因素轴向等高线变化越密集，该因素对响应值影响越显著，反之越弱。根据分析结果做出响应面曲面图及等高线图。在各因素的交互作用中，仅盐酸添加量和醋酸体积分数的交互作用是显著，结果如图2所示。4因素对醋酸木质素提取率的影响大小顺序依次为：HCl添加量、

图2盐酸添加量和醋酸体积分数对木质素提取率的响应面及等高线Fig.2Curvedsurfaceofresposeandcontourlineofhydrochloricacidamountandaceticacidconcentrationtotheligninyield

量、醋酸体积分数提取时间液料比，通过软件分析计算得出理论最佳提取工艺:提取时间80min、HCl添加量6%、液料比20∶1(mL∶g)、醋酸体积分数86.95%，实验中醋酸体积分数选取87%，该条件下醋酸木质素的提取率为73.58%，与预测相应值76.37%接近，说明试验结果与模型拟合良好，基于响应面法所得的优化提取参数准确可靠。

2.3笋壳及醋酸木质素基本成分分析

由表4可知，麻竹笋笋壳的主要成分为纤维素、半纤维素和Klason木质素，其含量分别为28.28%、37.63%、23.28%，占总成分含量的89.19%，为典型的木质纤维原料。在最优条件下提取的醋酸木质素纯度为89.70%。结合的碳水化合物的总量为2.96%，以木糖含量最高为1.36%，其次为阿拉伯糖、葡萄糖和纤维二糖，含量分别为0.67%，0.62%和0.31%。且提取木质素中灰分、脂肪、蛋白质远远低于笋壳中相应成分的含量。与LI等[11]采用醋酸法提取竹材中的木质素结合的碳水化合物的量(2.48%)相近。结果表明用醋酸法提取笋壳木质素过程中，有效断裂了木质素与多糖之间的化学连接，保证了提取木质素的得率及纯度，为木质素进一步应用提供了结构基础。

表4麻竹笋笋壳及醋酸木质素的成分分析单位：%

Table4Compositionanalysisofbambooshootshellandaceticacidlignin

2.4抗氧化活性

笋壳醋酸木质素对自由基DPPH清除效果如图3所示。以商业合成抗氧化剂BHT作阳性对照。IC50是自由基清除率达到50%时所需样品的浓度，RSI(radicalscavengingindex)值为自由基清除指数，是IC50的倒数，常用来评价抗氧化活性，其值越大，抗氧化活性越强。笋壳醋酸木质素抗氧化活性的RSI为1.61，显著高于商业合成抗氧化剂BHTRSI值为0.94。这与木质素中含有的活性基团(羟基、甲氧基、羧基等)有关，特别是酚羟基的含量[17-19]。VANESSA等[20]还进一步研究木质素作为抗氧化剂对人体影响，结果表明木质素对皮肤和眼睛无伤害。因此提取的笋壳醋酸木质素可用做天然的抗氧化剂，用来延长食用油及食品货架期，阻止食品的风味、颜色、活性维生素的丧失等[19]。既为抗氧化剂提供了新的来源，又为笋壳原料高附加应用提供新的方向。

图3笋壳醋酸木质素对DPPH的清除效果Fig.3AntioxidantactivityagainstDPPHofaceticacidligninfrombambooshootshell

3结论

本文以麻竹笋笋壳为原料，采用醋酸法提取木质素，通过响应面对提取木质素的工艺进行优化，结果表明：影响木质素提取效果的因素主次顺序是：B(HCl添加量)、D(醋酸体积分数)A(提取时间)C(液料比)。确定了最佳的工艺条件为,提取时间80min、HCl添加量6%、液料比为20∶1(mL∶g)、醋酸体积分数86.95%，该条件下得到的醋酸木质素提取率高达73.58%，纯度达到89.70%，含有少量的碳水化合物和蛋白质。笋壳醋酸木质素对DPPH自由基清除指数RSI为1.61，显著高于商业合成的抗氧化剂BHT(RSI0.94)，具有良好的抗氧化应用前景。

参考文献：

[1]吴金松,郑炯,夏雪娟,等.大叶麻竹笋多糖分离纯化工艺[J].食品科学,,36(2):80-84.

[2]黄伟素,陆柏益.竹笋深加工利用技术现状及趋势[J].林业科学,,44(8):-.

[3]YELY,ZhANGJM,ZHAOJ,etal.Liquefactionofbambooshootshellfortheproductionofpolyols[J].BioresourceTechnology,,(2):-.

[4]孙静亚,王惠君,杨玉霞.竹笋壳色素的提取及性质的研究[J].中国食品添加剂，(5):8-10.

[5]苏雅静,孙爱东,高雪娟.竹笋壳总黄酮提取工艺的响应面设计优化[J].食品工业科技,,31(1):-.

[6]GHAFFASH,FANM.Structuralanalysisforlignincharacteristicsinbiomassstraw[J].BiomassandBioenergy,,57(10):-.

[7]蒋挺大.木质素[M].北京:化学工业，:26-28.

[8]LIMF,SUNSN,XUF,etal.Microwave-assistedorganicacidextractionofligninfrombamboo:structureandantioxidantactivityinvestigation[J].FoodChemistry,,(3):-.

[9]RODRGUEZ-GUTIéRREZG,RUBO-SENENTF,LANA-MUNOZA,etal.Propertiesoflignin,cellulose,andhemicellulosesisolatedfromolivecakeandolivestones:Bindingofwater,oil,bileacids,andglucose[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,,62(36):-.

[10]MITJANSM,VINARDELLMP.Biologicalactivityandhealthbenefitsoflignansandlignins[J].TrendsComparativeofBiochemistryandPhysiology,2,11(3):55-62.

[11]LIMF,SUNSN,XUF,etal.Mildacetosolvprocesstofractionatebambooforthebiorefinery:structuralandantioxidantpropertiesofthedissolvedlignin[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,,60(1):-.

[12]VILLAVERDEJJ,LIJ,EKM,etal.NativeligninstructureofMiscanthus×giganteusanditschangeduringaceticandformicacidfractionation[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,,57(14):-.

[13]NREL/TP--.Laboratoryanalyticalprocedures(LAP):determinationofstructuralcarbohydratesandlignininbiomass[S].NationalRenewableEnergyLaboratory(NREL),.

[14]TAOBB,YEFY,LIH,etal.Phenolicprofileandinvitroantioxidantcapacityofinsolubledietaryfiberpowdersfromcitrus(Citrusjunossieb.extanaka)pomaceasaffectedultrafinegrindi,ng[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,,62(29):-.

[15]XUF,SUNJX,SUNRC,etal.Comparativestudyoforganosolvligninsfromwheatstraw[J].IndustrialCropsandProducts,,23(2):-.

[16]汪磊,云月英,游新勇,等.莜麦淀粉的提取及其性质的研究[J].中国粮油学报，,30(4)：23-27.

[17]AADILKR,BARAPATREA,SAHUS,etal.FreeradicalscavengingactivityandreducingpowerofAcacianiloticawoodlignin[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,,67(6):-.

[18]ZHOUS,LIUL,WANGB,etal.Microwave-enhancedextractionofligninfrombirchinformicacid:Structuralcharacterizationandantioxidantactivitystudy[J].ProcessBiochemistry,,47(12):-6.

[19]SUNSL,WENJL,MAMG,etal.Structuralfeaturesandantioxidantactivitiesofdegradedligninsfromsteamexplodedbamboostem[J].IndustrialCropsandProducts,,56(3):-.

[20]VANESSAU,MONTSERRATM,MARIAPV.Comparativeantioxidantandcytotoxiceffectsofligninsfromdifferentsources[J].BioresourceTechnology,,99(14):-.

Extractionandantioxidantactivitiesofligninfrombambooshootshell

GONGWei-hua1,2,RANZhan-xiang1,XIANGZhuo-ya1,YEFa-yin1,ZHAOGuo-hua1,3*

1(CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing，China)2(NormalCollegeofJishouUniversity,Jishou,China)3(ChongqingEngineeringResearchCentreofRegionalFoods,Chongqing,China)

Abstract：Ligninwasextractedfrombamboo(DendrocalamusLatiforus)shootshellbyaceticacidprocessandtheoptimumextractionconditionswereselectedbyresponsesurfacemethodology.Theeffectsofextractingtime,hydrochloricacidamount,ratioofliquid-solidandaceticacidconcentrationonyieldofligninwereinvestigated.Inaddition,the